摘要
特应性皮炎（AD）是一种常见的慢性炎症性皮肤病，病理生理学机制复杂，涉及屏障功能障碍和免疫失调等多种机制。一般认为，AD是由 2 型细胞因子（包括 IL-4、IL-5 和 IL-13）驱动的，这些细胞因子来源于Th2细胞、2 型先天性淋巴细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞和嗜酸性粒细胞。这些 2 型细胞因子会促进 IgE 合成，从而激活肥大细胞，导致随后由 IgE 介导的过敏性炎症。由角质形成细胞分泌的胸腺基质淋巴细胞生成素（TSLP）可能会进一步扩大 2 型细胞因子介导的炎症反应。此外，越来越多的证据表明，Th17 细胞也参与了 AD 发生发展。Meteorin-like protein（METRNL）是一种分泌蛋白，在肌肉再生、血管内皮炎症和败血症诱导的肾损伤过程中表现出抗炎表型。可促进METRNL表达的生理因素包括炎症、运动、寒冷、代谢状态以及激素调控等。然而，METRNL如何发挥对皮肤炎症的调控作用仍然未知。本研究旨在阐明 METRNL 在特应性皮炎（AD）中的功能和调控机制。该研究中，作者通过测定 AD 患者皮肤和血清样本中的 METRNL 水平，随后在维生素 D3 类似物 MC903 诱导的 AD 类小鼠模型中进行验证。通过多重免疫荧光、单细胞测序和RNA-seq鉴定了METRNL活性的细胞靶标。该研究发现与健康对照组相比，AD患者皮损和血清中的METRNL明显上调。反复接触 MC903 后，AD 模型小鼠耳朵和血清中的 METRNL 水平也均升高。给小鼠注射重组鼠 METRNL 蛋白（rmMETRNL）可改善过敏性皮肤炎症和 AD 的特征，而阻断METRNL 信号则会导致相反的结果。METRNL增强了β-Catenin的活化，限制了Th2相关分子的表达，而Th2相关分子则诱导了精氨酸酶-1（Arg1）hi巨噬细胞、树突状细胞和活化肥大细胞的聚集。该研究揭示了METRNL可与KIT受体结合，通过抑制免疫细胞的增殖，并通过调节WNT通路活性分子β-Catenin的水平来下调炎症基因的表达，从而缓解AD的过敏性炎症。
结果
1、 METRNL在AD患者和小鼠中表达增加
该研究首先比较了AD患者与对照人群、AD小鼠与对照小鼠血清METRNL水平，发现中度至重度AD患者的血清水平明显升高METRNL(图1A)。随后分析AD患者与对照人群的单细胞空间转录组数据，并发现与非AD病变和健康对照皮肤相比，AD病变皮肤中Metrnl阳性细胞的百分比显著增加(图1B)。通过免疫组化(IHC)染色，观察到AD患者病变中的角化细胞和浸润性免疫细胞中有强烈的棕色信号。相比之下，在健康对照组的皮肤样本中只观察到少量的角质形成细胞染色(图1C)。通过免疫荧光(IF)染色，确认CD11b+髓系细胞表达METRNL，其中部分细胞为CD11c双阳性DCs(图1D)。为了进一步研究METRNL在AD中的作用，采用了MC903诱导的AD小鼠模型，该模型涉及角质形成细胞中Th2-TSLP的上调和局部皮肤炎症部位Th2免疫反应级联的启动。发现与对照组小鼠相比，反复暴露于MC903的小鼠耳组织(图1E,F)和血清(图1G)中METRNL表达上调。此外，皮肤切片的多重免疫荧光染色显示，巨噬细胞(CD163+细胞)、嗜酸性粒细胞(Siglec-F+细胞)和角质形成细胞也表达METRNL(图1H)。这些结果提示METRNL参与了AD的发展。
2、在AD小鼠模型中，补充rmMETRNL可降低炎症反应
为了描述MC903处理对皮肤METRNL表达的影响，在局部应用MC903之前和期间，每隔48小时将小鼠METRNL重组蛋白(rmMETRNL)皮内注射入小鼠耳内(图2A)。发现MC903引起的耳朵皮肤增厚(炎症反应的一个指标)经rmMETRNL治疗后减轻(图2B)。未使用MC903的注射rmMETRNL小鼠的表型与假手术组相似。基于组织学，观察到与单独MC903组相比，使用rmMETRNL的AD样小鼠表现出耳厚和炎症浸润减少(图2C)，表明METRNL可抑制皮肤炎症。另外还发现MC903促进了了Il4、Il6、Tnf的mRNA表达和ARG1、MMP12的蛋白表达，而rmMETRNL的应用抑制了该效应 (图2D，E)。Westernblot结果还显示，rmMETRNL可上调KIT活性、β-Catenin和Tyr568/570磷酸化水平。这些数据表明，rmMETRNL的加入激活了WNT通路，下调了2型炎症分子，并改善了AD样炎症。
3、METRNL促进了MC903诱导的皮肤炎症和周围免疫器官的炎症免疫反应
该研究改探讨了腹腔注射rm-METRNL对MC903模型的影响。对AD样小鼠耳组织进行了多重染色，以证明MC903的应用增加了耳组织中METRNL+细胞、dc(CD11c+)、肥大细胞(KIT+)和CD4+细胞的数量。而rmMETRNL联合用药降低了CD11c、KIT和CD4的水平(图3A)。MC903处理后的耳切片空间相互作用分析显示，与阴性对照相比，METRNL+dc(CD11c+)、巨噬细胞(CD163+)和嗜酸性粒细胞(SiglecF+)与CD4+Th细胞密切相互作用(图3B)。为了了解METRNL+细胞对CD4+细胞的影响，通过mIF来表征接近METRNL+细胞的CD4+细胞的表型(图S1A)。结果显示，rmMETRNL给药后，Th2细胞(GATA3+CD4+)减少，Treg细胞(FOXP3+CD4+)和耗尽的CD4细胞(PD1+CD4+)显著增加(图S1B)。在确定了rmMETRNL对AD小鼠皮肤炎症反应的影响后，通过流式细胞术发现脾脏和皮肤引流淋巴结的免疫失效。值得注意的是，rmMETRNL注射减少了MC903处理小鼠脾脏的IL-4+CD4+Th2细胞和CD11b+Siglec-F+嗜酸性粒细胞(图3C)。以上结果表明，METRNL通过下调Th2炎症反应，在小鼠身体多个部位减缓了MC903诱导的AD的发展。
4、scRNA-seq数据显示，METRNL增加了Kit-表达细胞的WNT通路活性
该研究基于典型细胞类型标记，从转录组谱中手动筛选细胞簇，并在所有小鼠的耳朵中鉴定出14个不同的细胞簇，包括成纤维细胞(Fb)、4个角化细胞簇(基底、棘状、毛囊和皮脂腺)、免疫细胞和基质细胞(图4A)。此外，巨噬细胞和DCs均可由单核细胞衍生而来，因此作者首先将它们归类在同一簇中，称为“Mac./monoc./DC”。如图4B所示，Metrnl在小鼠耳细胞中表现出广泛的表达模式，包括但不限于棘状角化细胞、Fb和Mac./Mono./DC，而Kit基因广泛表达于肥大细胞，Fb,Mac./Mono./DC，内皮细胞等。诱导AD后，Mac./Mono.的百分比、DC和中性粒细胞增加，而加入rmMETRNL则减少了白细胞内流(图4C)。由于Fb和巨噬细胞是耳中Kit基因表达的主要细胞类型，对这两种细胞类型的生物学名词功能富集进行了解耦合分析，发现与MC903组相比，MC903+rmMETRNL组的WNT通路活性上调(图4D)。进一步将巨噬细胞分为8个簇，发现簇5以Arg1的高表达为特征，且在MC903组中最为丰富，高于rmMETRNL处理组(图4E)。该集群还富含Mmp12、Mmp14、Mmp19、Cxcl3、Il-1a和Spp1。这些结果表明，使用rm-METRNL可能通过上调WNT通路和减少浸润免疫细胞(尤其是Arg1)的数量来抑制皮肤炎症部位的巨噬细胞。
5、METRNL阻断可促进MC903诱导的AD样疾病的发展
为了研究METRNL在AD中的作用，该研究每隔一天将一种METRNL中和抗体注射入小鼠耳内，持续2周，注射后1天使用MC903处理(图5A)。在无炎症刺激的情况下注射抗METRNL抗体并没有引起耳增厚，但与MC903联合时耳增厚最为明显(图5B)。H&E染色显示应用MC903可导致真皮及其他部位的免疫细胞浸润。为了全面了解METRNL在皮肤炎症中调控的基因和通路，对小鼠耳组织进行了RNA测序。单样本基因集富集分析(ssGSEA)证实，在假手术组和仅注射抗METRNL抗体组之间存在最小的转录变异。然而，在MC903的刺激下，抗METRNL抗体的使用导致了各种炎症途径信号的显著放大，包括嗜酸性粒细胞的迁移和肥大细胞的激活。有趣的是，正调控WNT通路、甲基化和单泛素化蛋白去泛素化在抗METRNL联合MC903组中下调最多(图5D)。ELISA实验也证实了一些2型炎症分子的差异表达，包括IL-4、IL-6和TNF-α(图5E)，Westernblot证实了ARG1和MMP12的差异表达(图5F)。此外，Westernblot证实活性β-Catenin(WNT通路的重要成分)在anti-METRNL+MC903组中受到的抑制最大。简而言之，这些结果表明METRNL的中和作用抑制了WNT通路，上调了2型炎症分子，并加剧了AD样炎症。
6、METRNL的表达受环磷酸腺苷(cAMP)和维生素D受体(VDR)的调控
出于对导致METRNL表达的上游事件的好奇，作者通过分析公开的微阵列和RNA测序数据，检测了METRNL在不同细胞类型中的表达。观察到通过膜透性cAMP模拟物db-cAMP刺激Th17细胞后，METRNL表达上调(图6A)。作者也使用ELISA验证了这一结果。
结论
总之，该究提供了分子和免疫学证据，表明METRNL可能在调节皮肤炎症中具有重要作用。因此，研究结果为使用调节细胞因子治疗炎症发病机制和变应性疾病提供了一个生化基础。
供稿：谢海波
参考文献：Huang D, Liu X, Gao X, Choi CK, Giglio G, Farah L, Leung TF, Wong KC, Kan LL, Chong JW, Meng QJ, Liao J, Cheung PF, Wong CK. Meteorin-like protein/METRNL/Interleukin-41 ameliorates atopic dermatitis-like inflammation. Allergy. 2024 May 10. doi: 10.1111/all.16150.